Sviluppo di nuovi approcci terapeutici per COVID-19
Descrizione del progetto
Attività 2
Università di Parma e Università di Firenze
L'UO CIB di Parma coordinata da Paola Goffrini ed Enrico Baruffini e l'UO di Firenze coordinata da Duccio Cavalieri collaboreranno per ingegnerizzare varianti della proteina Spike in S. cerevisiae per poter vagliare l'efficacia di binding al recettore ACE2, nonché la capacità di neutralizzazione da parte di anticorpi e farmaci inibitori.
Produzione di varianti di spike SARS-CoV-2 in S. cerevisiae per studiare l'interazione del recettore SARS-CoV-2-ACE2, farmaci inibitori e nuovi antivirali.
1) Costruzione di due differenti ceppi di S. cerevisiae:
uno che esprime l'RBD della proteina spike, un secondo che esprime l'ACE2 umano, entrambi sulla superficie cellulare. Se miscelati insieme, i due ceppi daranno luogo a un fenotipo flocculante dovuto al legame di RBD con ACE2, che può essere facilmente osservato e misurato in piastre di coltura. L'ottimizzazione del sistema prevede la scelta di vettori di espressione appropriati, ceppi adeguati (ad esempio ceppi con parete cellulare alterata per migliorare l'interazione) e concentrazioni cellulari ottimali.
2)Screening su larga scala di librerie di molecole approvate dalla FDA utilizzando i ceppi prodotti. Lo screening sarà effettuato incubando uno dei due ceppi con le diverse molecole e, in un secondo momento, aggiungendo l'altro ceppo. Le molecole di interesse sono quelle in grado di revertire il fenotipo flocculante/aggregante. Inoltre, potrebbero essere espressi anche spike RBD con mutazioni trovate in alcune varianti di virus al fine di valutare se i farmaci identificati in precedenza potrebbero inibire anche in questo caso l'interazione RBD-ACE2.
L'UO CIB coordinata da Simone Ottonello e Barbara Montanini si propone di studiare l'interazione tra il recettore umano ACE2 e la proteina Spike di SARS-CoV-2 come bersaglio di un approccio integrato volto a prevenire l'internalizzazione del virus.Numerosi studi hanno identificato l'Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) come il recettore che media l'entrata di SARS-CoV-2 all'interno delle cellule dell'ospite. La struttura tridimensionale del complesso RBD-ACE2 ha messo in luce i dettagli dell'interazione tra ACE2 e la porzione apicale del dominio RBD della proteina Spike S1. Derivati ricombinanti del recettore ACE2 possono quindi funzionare da ‘trappole' per il virus (‘decoy'), in grado di sequestrarlo, e impedendone così l'interazione con le cellule bersaglio con un meccanismo simile a quello degli anticorpi neutralizzanti. Altrettanto interessanti, potrebbero essere ‘small-molecules' in grado di interferire direttamente con l'interazione tra ACE2 e S1-RBD. L'obiettivo del presente progetto è l'identificazione di inibitori dell'interazione ACE2-Spike, come strategia terapeutico-preventiva volta ad interferire con la fase più precoce del processo di infezione del virus SARS-CoV-2. Questo obiettivo verrà perseguito utilizzando due strategie complementari: i) lo sviluppo di ACE2 decoys derivati da un'approfondita analisi strutturale e formulati sotto forma di polveri inalabili; ii) l'identificazione di composti inibitori mediante un approccio di virtual screening seguito da un'analisi in vivo mediante tecnologia yBRET (yeast Bioluminescence Resonance Energy Transfer). Entrambi gli inibitori verranno valutati per la loro capacità di interferire con l'interazione Spike-ACE2 mediante saggi di neutralizzazione in vitro. Il decoy formulato come polvere inalabile verrà usato per test di efficacia in topi “umanizzati” per ACE2.
Attività 3
L'UO CIB coordinata da Roberto Corradini si propone di bersagliare i “frameshift elements” di Sars-CoV-2 mediante PNA e RNase-L binder-PNA coniugati. Diverse ricerche hanno dimostrato come il virus Sars-CoV-2 possa essere ostacolato da molecole razionalmente sviluppate per contrastare elementi vitali del virus. Uno di questi elementi è il ben noto processo Sars-CoV-2 e Sars-CoV-2 frameshifting che consente di produrre le proteine 1a e 1b usando due fasi di lettura (ORFs) sfasate dello stesso gene. Le basi molecolari che consentono il frameshift sono state caratterizzate e consistono in un “hairpin attenuator” (HA), uno “splippery site” (SS) e uno “pseudoknot frameshifting element” (FSE). Disney e collaboratori hanno selezionato molecole in grado di legarsi all'elemento Sars-CoV-2 AH ed hanno dimostrato che tale legame porta ad una riduzione dell'espressione virale. Allo stesso tempo, la possibilità di utilizzare RNA antisenso, siRNA ed altri approcci simili ha ulteriormente contribuito ad alimentare la ricerca per la progettazione razionale di composti per bersagliare l'RNA. A questo proposito, l'uso di peptide nucleic acids (PNA) rappresenta uno degli approcci più promettenti sia per l'elevata stabilità chimica ed enziamatica, sia per l'alta affinità di legame e selettività di sequenza. L'obiettivo di questo progetto consiste nel progettare e sintetizzare molecole di PNA capaci di legare la regione “pseudoknot” di Sars-CoV-2, in modo da impedire il processo di frameshift. Le migliori sequenze di PNA saranno coniugate al ligando dell'RNase-L in modo da permettere un'efficacia anche in quantità sub-stechiometriche.