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Descrizione del progetto

Italiano

OPA1, una GTPasi della membrana mitocondriale interna (IMM), è coinvolta in diverse funzioni mitocondriali, come l'organizzazione dinamica del reticolo, l'efficienza della fosforilazione ossidativa (OXPHOS), la stabilità del DNA mitocondriale (mtDNA) ed il controllo dell'apoptosi.
Nell'uomo OPA1 è espressa in otto isoforme, derivanti dallo splicing alternativo degli esoni 4, 4b e 5b, specifiche per tessuto/organo, e di funzione ancora poco definita.
L'attività GTPasica di OPA1 richiede il fosfolipide cardiolipina (CL), che contribuisce alla fusione mitocondriale e all'organizzazione strutturale della IMM e delle cristae, oltre a fungere sa supporto per l'organizzazione dei super-complessi della OXPHOS. Anche l'ortologo di OPA1 nel lievito, Mgm1, necessita di CL per formare oligomeri e svolgere la sua attività fusogena.
Il nostro primo obiettivo è quello di identificare la specifica funzione mitocondriale di ogni isoforma, generando e caratterizzando linee stabili derivate da MEF OPA1 nulle che esprimono singolarmente le otto isoforme di OPA1.
L'atrofia ottica dominante (DOA), una neuropatia ottica con degenerazione selettiva delle cellule gangliari della retina, è causata da mutazioni nel gene OPA1. La maggior parte di queste mutazioni genera codoni di stop, che producono una proteina tronca che viene degradata, per cui il meccanismo genetico suggerito è l'aploinsufficienza. Tuttavia alcune mutazioni missenso provocano la DOA plus, un disordine multisistemico più complesso, caratterizzato oltre che da DOA, anche da miopatia mitocondriale con delezioni nel mtDNA. OPA1 è stata quindi inserita tra i geni associati a patologie caratterizzate da delezioni del mtDNA (sindromi CPEO), a conferma del suo coinvolgimento nella stabilità del mtDNA, come Mgm1.
Come secondo obiettivo ci proponiamo di correlare l'espressione delle diverse isoforme di OPA1 con l'integrità del mtDNA, utilizzando cellule e tessuti derivati da pazienti con diverse mutazioni su OPA1. A tale scopo useremo alcune strategie sperimentali per riprodurre in vitro l'accumulo di delezioni nel mtDNA in un ampio gruppo di fibroblasti con le diverse mutazioni.
I geni e le vie mitocondriali sono molto conservati tra uomo e lievito, rendendo quest'ultimo un modello efficace per lo studio delle malattie mitocondriali. Il nostro terzo obiettivo è proprio quello di riprodurre nel lievito le diverse mutazioni di OPA1, tra cui quelle che causano aploinsufficienza e quelle che introducono una sostituzione aminoacidica, al fine di confermare i dati ottenuti nell'uomo e fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base della stabilità del mtDNA, del metabolismo della CL e dell'efficienza energetica.
Siamo convinti che questo progetto contribuirà a chiarire il ruolo di OPA1 e farà luce non solo su DOA e DOA-plus, ma anche su altre malattie neurodegenerative caratterizzate da instabilità del mtDNA.

English

Human OPA1 gene encodes a GTPase inserted in the inner mitochondrial membrane (IMM). Eight isoforms, resulting from alternative splicing of exons 4, 4b and 5b,
have been reported and shown to be implicated in several functions, such as mitochondrial dynamics, oxidative phosphorylation (OXPHOS) efficiency, mitochondrial
DNA (mtDNA) maintenance and control of apoptosis. In particular, OPA1 isoforms with exon 4 have been involved in network dynamics as well as in OXPHOS
efficiency, whereas those containing exon 5b could shape the cristae junction bottleneck (Landes et al. 2010 Semin Cell Dev Biol). We have recently reported that
OPA1 isoforms with exon 4b are crucial in mtDNA maintenance by contributing to nucleoids attachment at the IMM (Elachouri et al. 2011 Genome Res). However,
all these findings have been achieved through down-regulation of specific OPA1 isoforms, i. e. in a cellular background expressing the endogenous OPA1 isoforms,
which may have influenced the observed results.
Of interest is that the OPA1 GTPase activity requires the charged phospholipid cardiolipin (CL), which is well known to affect the efficiency of mitochondrial fusion
and contribute to the shape of IMM and cristae, as well as act like a lipid scaffold for the supramolecular organization of OXPHOS complexes (Schug et al. 2011
Acta Oncol). Intriguing Mgm1, the yeast orthologue of OPA1, requires CL for proper assembly into high order oligomers and for pro-fusion activity (DeVay et al.
2009 JBC). Our preliminary results obtained in OPA1 null MEF (mouse embryonic fibroblasts) show, in addition to a remarkable reduction of energetic efficiency, a
severe impairment of the complexes/supercomplexes organization and a dramatic decrease in CL levels. This opens a new exciting area of investigation, linking
OPA1, as well as its pathological mutants, to CL metabolism and mitochondrial energetic function.
Our first aim is to generate OPA1 null MEF expressing each of the OPA1 isoforms and analyze their specific role in the absence of endogenous OPA1. The extensive
characterization of these cells (mitochondrial energetics, OXPHOS supra-molecular organization, network morphology, lipid composition, mtDNA maintenance,
apoptosis/autophagy) will hopefully allow us to associate each OPA1 isoform to a specific mitochondrial function.
OPA1 is the major gene responsible for dominant optic atrophy (DOA), a blinding disease with selective degeneration of the retinal ganglion cells and optic nerve
atrophy. Most of the OPA1 mutations are predicted to produce a truncated protein, indicating haploinsufficiency as the molecular mechanism underpinning DOA
(Amati-Bonneau et al. 2009 Int J Biochem Cell Biol; Zanna et al. 2008 Brain). However, a complex multisystem disorder named "DOA-plus", including DOA and
mitochondrial myopathy with accumulation of mtDNA multiple deletions, has been also associated with specific missense OPA1 mutations (Amati-Bonneau et al.
2008 Brain). Thus, OPA1 has been added to the list of genes (ANT1, Twinkle, POLG, MFN2) associated with human disorders characterized by mtDNA deletions
(CPEO syndromes), supporting the role of OPA1 in mtDNA maintenance as Mgm1. Interestingly, we recently documented the first families with CPEO and
parkinsonism carrying missense mutations in the OPA1 GTPase domain (Caporali 2010 Mit Med).
The OPA1 isoforms expression profile, which differs according to the tissue and organ considered, may play an important role in the patho-physiology of the OPA1
mutations.
Our second aim is focused on disclosing the relationship between OPA1 isoforms expression level and mtDNA maintenance, as studied in vitro using cell lines and ex
vivo in tissues derived from patients with different OPA1 mutations. We plan to achieve this goal by setting up paradigms of in vitro cell challenge to force the
occurrence of multiple mtDNA deletions in a large panel of OPA1 mutant fibroblasts, and then to analyze mtDNA maintenance in close relationship to the OPA1
isoforms profile.
Mgm1 is the yeast orthologue of OPA1; the high conservation of mitochondrial genes and pathways between human and yeast and its easy manipulation, makes it a
valuable model to study mitochondrial diseases.
Our third aim is therefore to model in yeast the different human OPA1 mutations, including those causing haploinsufficiency vs. those determining amino acid
changes in the protein, in order to confirm the data obtained in humans and possibly get new information on the mechanisms underlying mtDNA maintenance, CL
metabolism and respiratory proficiency.
In conclusion we are confident that this project will contribute to further understand the role of OPA1 protein and

Risultati e pubblicazioni

Pubblicazioni

Del Dotto V, Fogazza M, Musiani F, Maresca A, Aleo SJ, Caporali L, La Morgia C, Nolli C, Lodi T, Goffrini P, Chan D, Carelli V, Rugolo M, Baruffini E, Zanna C. (2018) Deciphering OPA1 mutations pathogenicity by combined analysis of human, mouse and yeast cell models. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease 1864(10) 3496-3514 [DOI  PMID]

Nasca A, Legati A, Baruffini E, Nolli C, Moroni I, Ardissone A, Goffrini P, Ghezzi D. (2016) Biallelic Mutations in DNM1L are Associated with a Slowly Progressive Infantile Encephalopathy. Human mutation 37(9) 898-903 [DOI  PMID]

Nolli C, Goffrini P, Lazzaretti M, Zanna C, Vitale R, Lodi T, Baruffini E. (2015) Validation of a MGM1/OPA1 chimeric gene for functional analysis in yeast of mutations associated with dominant optic atrophy. Mitochondrion 25 38-48 [DOI  PMID]